一、操作流程

這里以大家最常用的大腸埃希菌為例，其它菌種方法類似。

(資料圖片)

1，菌種制備：從菌種保藏管中吸取少量菌液，轉接到新鮮的TSB中，于30℃-35℃培養箱中培養18-24小時。

2，稀釋：取步驟1的培養物1mL，加入到9mL的pH7.0氯化鈉蛋白質緩沖液中，進行倍比稀釋。

3，平板計數：取稀釋好的菌液，一般取3個稀釋級，每個梯度取2mL，分別加入兩塊90cm的平皿中，每皿加入1mL菌液，傾注45℃左右的已經經過確定的TSA培養基，輕輕搖勻，靜置，培養基凝固后，置30-35℃培養箱中倒置培養48小時。

4，菌落計數：將培養后的平板，置于菌落計數器下進行菌落計數，以確定哪個稀釋級的濃度能夠滿足測試的要求。

二、對應注意事項

1，菌種制備：也可以使用TSA平板進行培養，如果轉接的是冷凍保藏管中的菌，最好再轉接一次，使用第二次轉接的菌種。

2，稀釋：取菌液的時候，需要先對菌液進行振蕩或吹打混勻，方可吸取菌液。可以不用進行倍比稀釋，只要能保證最后加入到測試樣品中的菌的數量符合要求即可。

3，平板計數：取菌液時同樣需要先將試管中的菌液進行混勻。

4，培養基菌落計數：不建議逐日觀察結果，因為平板中可能有凝集水， 逐日觀察拿動平板，可能會導致水落到菌落上，菌跟著水流到下一個空白地方，導致結果不準確；另外如果是霉菌，因為有孢子，拿動也會導致孢子落到平板空白地方，影響結果。

三、事后思考

1、菌液的作用

菌懸液使用有時效性要求：

2020版《中國藥典》和《歐洲藥典》8.0版要求如果放置在室溫，菌懸液必須在2小時內使用，如果放置在2-8℃保存，可以在24小時內使用。

那么問題來了，菌懸液的菌的數量需要在48小時后才能確定，但是在24小時之內菌懸液必須使用，所以在不知道菌含量的情況下，樣品測試需要做至少三個梯度。

筆者之前在微生物實驗室做了5次的菌懸液制備，為了保證實驗的成功，每次都是要做三個梯度，雖然大多數都是同一個稀釋級的含量符合要求，但是還是偶爾有另一個稀釋級才符合要求的時候，所以筆者每次都乖乖的做三個梯度的測試，還好筆者那個時候依據的法規中，日常的無菌檢查和控制菌檢查中沒有陽性對照的要求。

這里說的三個梯度不是說只是計數，而是菌懸液實際運用的測試中也需要三個梯度，舉個例子，某個無菌產品無菌檢查中的陽性對照測試，需要做三個對照。當然，同樣的產品方法適用性，培養基促生長測試也是如此。流程圖如下：

2、步驟的繁瑣

這個流程圖中，還是省略了一些步驟，一句話帶過的倍比稀釋，做過的小伙伴們知道，這個說起來容易做起來難。

另外在接收菌種和從冷凍保藏管中取出菌種來使用時，還需要進行相應的鑒定，所以不要覺得這個流程好冗長，其實已經是簡單版的。